2019年10月1日（rì），5-羟甲基化胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在（zài）糖尿病研（yán）究领域（yù）取得（dé）重要进展。2型糖尿病（T2D）的（de）血（xuè）管并发症（zhèng）是导致2型糖尿病致（zhì）残（cán）致死的（de）重要病因，一直缺乏一种无创（chuàng）便捷的（de）临床途径实现血管并发症（zhèng）的发生（shēng）发展监测，达到（dào）早发现、早干预，以提（tí）高T2D病人（rén）的整体生活质（zhì）量（liàng），减少（shǎo）卫（wèi）生经济（jì）负担。

该研究入组了62例2型糖尿病病人，采用5hmC-Seal技术对血（xuè）浆cfDNA中表观遗（yí）传标志物5hmC的分布情况进行（háng）检测，分析5hmC标志物与2型（xíng）糖尿病血管并发症发生发展的相（xiàng）关性。结果表明5hmC标志物的变化与T2D合并大血管/微血（xuè）管事（shì）件具（jù）有（yǒu）相关性，主要涉及一些与血管生（shēng）物学（xué）和糖尿（niào）病（包括胰岛素耐受和炎症反应）相关的基因和信号通路（lù）。该（gāi）研究建立的（de）16个基因（yīn）-5hmC标志（zhì）物组合检（jiǎn）测可以准确区（qū）分有并发（fā）症和无并发症的2型糖尿病病人（rén）[实验组：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优于传（chuán）统临（lín）床变（biàn）量例如白蛋（dàn）白尿（niào）。除此之外（wài），还建立了13个（gè）基（jī）因-5hmC标（biāo）志物组合检测，可以进一步区分T2D合并单一（yī）并发症和多种并（bìng）发（fā）症[实验组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明显优于其他传统临床变量。该研究（jiū）得出结论，5hmC标志（zhì）物（wù）反映了T2D病（bìng）人大血管/微血管并发症发生过（guò）程中的表观遗传变化（huà），因（yīn）而5hmC-Seal检测（cè）技术（shù）在监测（cè）糖尿（niào）病血（xuè）管（guǎn）并发症（zhèng）发生和进展方面具（jù）有良好（hǎo）的临床应用（yòng）前（qián）景。

本研（yán）究共（gòng）纳（nà）入62例2型糖尿病病（bìng）人（rén），包括没有血管并发症的病人12例，有单一血管并发症的病人34例（24例发生大血管事件，10例发（fā）生微血管（guǎn）事件），以及有多种血（xuè）管并发症的病人16例。试验收集62例病人（rén）血浆（jiāng），提（tí）取cfDNA，利用（yòng）5hmC-Seal技术（shù）捕获外周血cfDNA中的5hmC序（xù）列（liè），进行（háng）二（èr）代测（cè）序，通（tōng）过（guò）生物信息学分（fèn）析（xī）找出并发症（zhèng）组与无并发症组之间有显（xiǎn）著（zhe）5hmC修饰差异的基因，单一并发症组和多（duō）种并发（fā）症组之间有显著5hmC修饰差异的基因。随后利用回归模型对差（chà）异基因进一（yī）步筛选、优化，弹性网络进一步筛选，计算（suàn）加权平均分，最（zuì）后得（dé）到一组具有（yǒu）高度灵敏度和（hé）特异性的5hmC生物标记（jì）物，并进一步在实验（yàn）组中验证，分析其灵敏度和（hé）特异性。并将新建立的（de）5hmC标志（zhì）物（wù）基因组（zǔ）合的检（jiǎn）测性能与传统临床（chuáng）变量进行对比分析。最（zuì）后对相关基因进（jìn）行了信（xìn）号通路分析和功能探究。

5hmC修饰水平与血（xuè）管并发症具（jù）有（yǒu）相关性

利用逻辑回归模型对62例有并发症（zhèng）和无并（bìng）发症（zhèng）2型糖（táng）尿病病人的5hmC差异水平进（jìn）行（háng）分（fèn）析发现，有并发症2型糖尿病病（bìng）人的622个差异（yì）修（xiū）饰候选基（jī）因（yīn）（包括上（shàng）调（diào）和下调（diào）基（jī）因）的归一化（huà）平均数要明显高于（yú）无并发（fā）症的病（bìng）人（P<0.001），但是单一并发症和多发并发（fā）症病人之间没有显著差异。

之后将有单一并发症或（huò）多种并发症的50例病人用逻辑（jí）回归模型（xíng）进行了对比，发现（xiàn）多种并发症的病人的153个差异修饰候选基因（包括上调和下（xià）调基因）的归一（yī）化平均（jun1）数（shù）要低于无并发症病人（rén）（P<0.001）。

5hmC标志物可区分有无（wú）并发症患者

62例（lì）2型糖尿病（bìng）病人被（bèi）随机分成（chéng）训（xùn）练组（n=31）和测（cè）试组（n=31）。利用弹（dàn）性网络筛选后发现，16基因-5hmC标志物组合检测可以用于（yú）区（qū）分有并发症和无（wú）并发症的2型糖尿（niào）病病人（rén）。

基于16基因组合模（mó）型 (Detection Model 1) 的加权平（píng）均分分析，发现无并发症（zhèng）病人的分数在训（xùn）练集和测试集中都明显低于有并发症的病人。只考虑加权平均分的话，受（shòu）试者工作特征曲线（ROC）分析表明将cutoff值设置（zhì）成0.5时，在测试组（zǔ）中中的灵敏度为60%，特异性（xìng）为100%。

5hmC标志物可区分病人（rén）是单一（yī）并发症还是多种并发症（zhèng）

50例（lì）有并发症（zhèng）的2型糖尿病（bìng）病人被（bèi）随机分（fèn）成训练组（n=25）和测试组（n=25）。利用（yòng）弹性网络筛（shāi）选后（hòu）发现，13基因-5hmC标志物组合可以区分2型糖尿病病人是否发生单一并发症或多种并发症。

基于13基（jī）因（yīn）组合（hé）模型 (Detection Model 2)， 我们计算了单（dān）一并发症和多种并发症的加权平均分，发（fā）现在训练集和测试集中单一并（bìng）发（fā）症和多种（zhǒng）并（bìng）发症病人的分数都有明显差异。值得一提的是，有肾病并发症和无肾病并发症病人的分数也有明显差异。利用加（jiā）权平均分作为（wéi）判断标（biāo）准的受试（shì）者工作特（tè）征曲线（ROC）表明，在测（cè）试组中当将cutoff值设成0.69时，灵敏度为87.5%，特异性为（wéi）68.8%。

5hmC标志物（wù）与（yǔ）传统（tǒng）临床变量/危险（xiǎn）因子的（de）对（duì）比

我们评估了不同临床变量/危险因子用（yòng）于监（jiān）测血管（guǎn）并发症的灵敏（mǐn）度和（hé）特异性（见表1）。

信号通路分析和（hé）功能探究

有并发症（zhèng）和无并发（fā）症病（bìng）人的135个差异候选基因的功能注释（shì）分析表（biǎo）明，这些基（jī）因主要富集在一些经（jīng）典的（de）信号通路。错误（wù）发现率相关（guān）P值位于前10%和（hé）基（jī）因数目≥3的信（xìn）号通路包括由IGF1R, IL-10和FGFR2所介导的信号通路。由IGF1R和（hé）IL-10介导的信号通（tōng）路与胰岛素抵抗及炎症反应相关，在血管生物（wù）学（xué）和糖尿病发生发展过程（chéng）中发挥（huī）重要（yào）作用。

Reactome相互（hù）作（zuò）用网络的中心（xīn）表（biǎo）明，泛素编（biān）码基因[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛素A-52亚基（jī）核糖体蛋白（bái）融合产物1(UBA52)]是候（hòu）选基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和（hé）TBCC）的重要（yào）连接者。在这135个（gè）差异（yì）候选（xuǎn）基（jī）因中, 一些基因 （如（rú）TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表（biǎo）现出与糖尿病（bìng）病程相关的倾向，表明5hmC和糖尿（niào）病血管并发症之间可能存在时间依赖性的（de）相互（hù）作用（yòng）。基于纵向时间（jiān）队（duì）列的大（dà）样本（běn）研究，将（jiāng）可进一（yī）步明确5hmC变化和糖尿病持（chí）续时间之间的（de）动（dòng）态关联（lián）。关于单一并发症和多种（zhǒng）并发症病人的159个候选标志基（jī）因的（de）功（gōng）能注释研（yán）究发现，存在细（xì）胞-细胞连接（jiē）、胶（jiāo）原蛋（dàn）白形成、新陈代谢、细胞应激应答信号通路的（de）富集，这（zhè）些信号通路（lù）均与细胞基（jī）本（běn）功能（néng）密切相关。

血管并发症是（shì）三分之二糖尿（niào）病（bìng）病（bìng）人的死（sǐ）亡原因，若（ruò）能（néng）及早有（yǒu）效控（kòng）制血管并发症（zhèng）的发生，将（jiāng）极（jí）大地（dì）改善糖（táng）尿病（bìng）病人的（de）生存（cún）质量。该研究建立了一（yī）种利用cfDNA进行（háng）2型糖（táng）尿病血管并（bìng）发症监测的无（wú）创便捷方法（fǎ），较目（mù）前临床（chuáng）标志物能更（gèng）准确（què）地监控血管并发症（zhèng）的发生，从而提（tí）示临床及早采（cǎi）取应对措施，有效控制病情进展。