2019年10月1日，5-羟甲基化（huà）胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖尿病研究领域取得重要进（jìn）展。2型糖尿（niào）病（T2D）的血管（guǎn）并发症是导致2型糖尿病致残致（zhì）死（sǐ）的重要病因，一直缺乏（fá）一（yī）种无创便捷的临（lín）床途径实现（xiàn）血管并发症的（de）发生（shēng）发展监测，达到早发现、早干预，以提高（gāo）T2D病人的整体生（shēng）活质量（liàng），减（jiǎn）少卫生经济负担。

该研究（jiū）入组了62例2型糖尿病（bìng）病人（rén），采（cǎi）用5hmC-Seal技术对血浆cfDNA中表观（guān）遗（yí）传标志（zhì）物5hmC的分布情（qíng）况（kuàng）进行检测（cè），分析5hmC标志（zhì）物与2型糖尿病血（xuè）管（guǎn）并发症发生发展的相关性。结果表（biǎo）明5hmC标志物的（de）变化与（yǔ）T2D合（hé）并大血（xuè）管/微（wēi）血管事（shì）件具有相（xiàng）关性，主要（yào）涉及一（yī）些（xiē）与血管生（shēng）物学和糖尿病（bìng）（包括胰岛素耐受和炎（yán）症反应）相关（guān）的（de）基因和（hé）信号通路。该（gāi）研究建立（lì）的16个（gè）基因-5hmC标志物组合检测可以（yǐ）准（zhǔn）确区（qū）分有并发症和无并发症（zhèng）的2型糖尿病（bìng）病人[实（shí）验组：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优于传（chuán）统（tǒng）临（lín）床变量例如（rú）白蛋白尿。除此之外，还建立了（le）13个基因-5hmC标志物组合检测，可以进一步（bù）区分T2D合（hé）并单一并发症和多种并发（fā）症（zhèng）[实（shí）验组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样（yàng）明显（xiǎn）优于其他传统临床变量。该研究得出结论，5hmC标志物反映了T2D病（bìng）人大血管/微血管并发症发生过程（chéng）中的表（biǎo）观（guān）遗传变化（huà），因而5hmC-Seal检测技术在监测糖尿病血管并发（fā）症发生和进（jìn）展方（fāng）面具（jù）有良好的临床应用前景。

本研究共纳（nà）入62例2型（xíng）糖（táng）尿（niào）病病人，包括没有血管并发症的病人12例，有单一血（xuè）管并发症的病人34例（lì）（24例发生大血管事件，10例发生微血管（guǎn）事件），以及有多种血管并发症的病（bìng）人16例（lì）。试验收集62例病人血浆，提（tí）取cfDNA，利（lì）用（yòng）5hmC-Seal技术捕获外周血cfDNA中的5hmC序列，进行二代（dài）测序，通过生物（wù）信息学分析找（zhǎo）出（chū）并（bìng）发症组与无并发（fā）症组之间有显著5hmC修饰差异的基因，单一并发（fā）症组和多种并发症组之（zhī）间（jiān）有显著5hmC修饰（shì）差异的基因。随后利用回归模型对（duì）差异基因（yīn）进（jìn）一步筛选、优化，弹性网络进一步筛选，计算加（jiā）权平均分，最后得到一（yī）组具有（yǒu）高（gāo）度灵敏度和特异（yì）性（xìng）的5hmC生物标记物，并进一步在（zài）实验组中（zhōng）验证，分析其灵敏度和特异性。并（bìng）将新建立的5hmC标志物基（jī）因组（zǔ）合的检（jiǎn）测性能与传统临床变量进行对比分析。最后（hòu）对相关基因进行了信号通（tōng）路分析和功能探（tàn）究。

5hmC修饰水平（píng）与血管（guǎn）并发（fā）症具有相关性

利用（yòng）逻辑回（huí）归模（mó）型对（duì）62例（lì）有并发症和（hé）无并发症2型（xíng）糖尿病病人（rén）的5hmC差异（yì）水平（píng）进行分析发现，有并发症2型糖尿病病（bìng）人的622个（gè）差异修饰候选基（jī）因（包（bāo）括上调和下调基因）的归一化平均数要明显高于（yú）无（wú）并发症（zhèng）的病人（P<0.001），但是单一并（bìng）发症和多发并（bìng）发症病（bìng）人之间没有（yǒu）显著差（chà）异。

之后将有单一（yī）并（bìng）发症或多种（zhǒng）并发症的50例（lì）病（bìng）人（rén）用逻辑回（huí）归模型（xíng）进行了对比，发现多（duō）种（zhǒng）并发症的病人的（de）153个（gè）差（chà）异修饰候选基因（包括上调和下调基因）的归一化平均数要低于无并发症病人（P<0.001）。

5hmC标志物可区分有无并发症患者

62例2型糖尿病病人被随机（jī）分成训练组（n=31）和测试组（n=31）。利（lì）用弹性网络筛选后发现，16基（jī）因-5hmC标志物组合检测可以用于区分有并发症和无并发（fā）症的2型（xíng）糖尿病病人。

基于16基因组（zǔ）合模型 (Detection Model 1) 的（de）加权平均分分析，发现无并发症病（bìng）人的（de）分数在训练集和（hé）测试集中（zhōng）都（dōu）明显低（dī）于（yú）有（yǒu）并发症的病人。只考虑加权平均分的话，受试者工作特（tè）征曲线（xiàn）（ROC）分析表明将（jiāng）cutoff值设置成0.5时，在测试组中中（zhōng）的灵敏度为60%，特异性为（wéi）100%。

5hmC标志物可（kě）区分病人是单一并发症还是多（duō）种并发症

50例有并发症的2型糖尿病病人被随机分成训（xùn）练组（n=25）和测试（shì）组（n=25）。利（lì）用弹性网络筛选后发现，13基因-5hmC标志物（wù）组合可以区分（fèn）2型糖尿病病（bìng）人是否发生（shēng）单（dān）一并（bìng）发症或多种并发症。

基于（yú）13基因组合（hé）模型 (Detection Model 2)， 我们计算了（le）单一并发症和多种并发症的加权（quán）平均分，发现在训练集和测试（shì）集中单一并发（fā）症和多种（zhǒng）并发（fā）症病人的（de）分数都有明显差异。值得一（yī）提（tí）的是，有肾病并发症和无肾病并发症病人的分数也有（yǒu）明显（xiǎn）差异（yì）。利用加权（quán）平均分作为（wéi）判断（duàn）标准的受试者工作（zuò）特（tè）征曲线（ROC）表明，在测试组中（zhōng）当将cutoff值设成0.69时，灵敏度为87.5%，特异性（xìng）为68.8%。

5hmC标（biāo）志物与传统（tǒng）临床变量/危险因子的对比

我们评估了（le）不（bú）同临床变量/危险因子用于监测血管并（bìng）发症的（de）灵（líng）敏（mǐn）度和特异（yì）性（见表1）。

信号通路（lù）分（fèn）析和功能探（tàn）究

有并发（fā）症和无并发症（zhèng）病人（rén）的135个（gè）差异候（hòu）选（xuǎn）基因的功能注释分析表明，这（zhè）些基因主要（yào）富（fù）集在一（yī）些经典的信号（hào）通路。错误发现率相关P值位于前10%和基因数目≥3的信（xìn）号通路包（bāo）括由IGF1R, IL-10和FGFR2所介导的信号通（tōng）路（lù）。由IGF1R和IL-10介（jiè）导的信号通路与胰岛素抵抗及炎症（zhèng）反应相关，在（zài）血管生物学和糖尿病（bìng）发（fā）生（shēng）发展过程（chéng）中发挥重要作用。

Reactome相互作用网络的中心表明，泛素编码基因[泛素B (UBB)，泛（fàn）素C (UBC)，泛素A-52亚（yà）基核糖体蛋白融合产物1(UBA52)]是候选（xuǎn）基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重要连接者。在（zài）这135个差异（yì）候选基因中（zhōng）, 一（yī）些基因（yīn） （如（rú）TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表（biǎo）现出（chū）与糖（táng）尿病病程相（xiàng）关的倾向（xiàng），表明5hmC和糖尿（niào）病血管并发症之间可能存在时（shí）间依赖（lài）性的相互作用。基于纵向时间队列的大样（yàng）本研究，将可进一步明确5hmC变化和（hé）糖尿病持续（xù）时间之间的动态（tài）关联（lián）。关于单（dān）一并发症和多种并发症病人的159个候选（xuǎn）标（biāo）志基因的功能注释研究发（fā）现，存在（zài）细胞-细胞连接（jiē）、胶原（yuán）蛋白形成、新陈代谢（xiè）、细胞（bāo）应激应答信号通路（lù）的富集，这些信号通路（lù）均与（yǔ）细（xì）胞基本功（gōng）能密（mì）切相关。

血管并发症是三分之二糖尿病（bìng）病人的死亡原因，若能及早有效控制血管并发症（zhèng）的发（fā）生，将极（jí）大地改善（shàn）糖（táng）尿病病（bìng）人的生存（cún）质量。该研究建立了一种（zhǒng）利用cfDNA进行2型糖尿病血管（guǎn）并发症监测的无创（chuàng）便（biàn）捷方法，较目前（qián）临床标志物能更准确地监控（kòng）血（xuè）管并发（fā）症的发生，从而（ér）提示临床及早采取应（yīng）对（duì）措施，有（yǒu）效控（kòng）制病情进展。